Метод медленного замораживания и хранения эритроцитов
Метод медленного замораживания и хранения эритроцитов при -30 град. С
Метод предназначен для криоконсервирования эритроцитов при температуре -30 град. С и предусматривает использование электрических холодильников. Замораживание осуществляют в стеклянных бутылках или полимерных контейнерах, в которых заготавливается кровь.
Для криоконсервирования эритроцитов, их длительного хранения в электрохолодильниках при -30 град. С и последующего отмывания методом серийного центрифугирования применяют один из двух ограждающих растворов (ЦНИИГПК 11 55, ЦНИИГПК 11).
1. Смешивание эритроцитной массы с ограждающими растворами проводят в первичных емкостях, в которых была заготовлена консервированная кровь: бутылки вместимостью 250 мл, полимерные контейнеры на 500 мл. С раствором 11 55 эритромассу смешивают в соотношении 1:1.
При замораживании с криоконсервантом 11 эритроцитную массу смешивают с раствором в соотношении 1:1,6. К каждым 125 мл эритромассы добавляют 200 мл раствора.
2. Глицеринизацию эритроцитов осуществляют в течение 10 минут при легком покачивании сосуда с кровью. После герметизации, маркировки и экспозиции при комнатной температуре в течение 15-20 минут бутылки или полимерные контейнеры помещают в специальные сетки (кассеты, бязевые мешки, коробки) и переносят для замораживания и хранения в электрохолодильники.
Полимерные контейнеры с глицеринизированной эритромассой, помещенные в кассеты или картонные коробки, в камере электрохолодильника размещают в горизонтальном положении. Через сутки после замораживания при необходимости они могут быть переведены в вертикальное положение.
3. При замораживании эритроцитов в виде эритроконцентрата эритроциты медленно (в течение 10 мин) при постоянном помешивании соединяют с раствором 11 55 в соотношения 1:1. Взвесь центрифугируют в течение 20 минут - 1100 g при +4 град. С. После удаления надосадочной жидкости и герметизации сосуда его помещают на хранение в электрохолодильник.
4. Оттаивание проводят в водяной бане с температурой 38-40 град. С в течение 6-10 минут до полного исчезновения льда.
5. Деглицеринизацию размороженных эритроцитов проводят в полимерных контейнерах вместимостью 500 мл с применением солевых или маннитно - солевых растворов.
Этапы отмывания эритроцитов, замороженных с раствором 11 55
I этап
К размороженной эритроцитной взвеси (250 мл), переведенной из емкости для замораживания в полимерный контейнер, постепенно добавляют, помешивая, вначале 100 мл 6% раствора NaCI (или 16% раствора маннита) через 2-3 минуты - 150-200 мл 2% раствора NaCI (или 5% раствора маннита). Разведенную эритроцитную взвесь центрифугируют при 1100 g в течение 10 минут.
II этап
После удаления надосадочной жидкости к оставшимся эритроцитам, после их осторожного перемешивания, добавляют 400-450 мл 1% раствора NaCI (или 2,5% раствора маннита). Взвесь эритроцитов центрифугируют при том же режиме, но в течение 5 минут и снова отделяют надосадочную жидкость.
III этап
Повторить этап II.
После удаления надосадочной жидкости отмытые эритроциты ресуспендируют в растворе ЦНИИГПК 8в.
Этапы отмывания эритроцитов, замороженных с раствором 11
I этап
К размороженной эритроцитной взвеси (325 мл), хранившейся в полимерном контейнере, добавить, постепенно помешивая, 200 мл 4% раствора NaCI (или 16% раствора маннита). Через 2-3 минуты разведенную взвесь эритроцитов центрифугируют при 1100 g в течение 10 минут.
II этап
После удаления надосадочной жидкости к оставшимся эритроцитам, после их перемешивания, добавляют 400-450 мл 2% раствора NaCI (или 5% раствора маннита). Взвесь центрифугируют при том же режиме в течение 5 минут и снова удаляют надосадочную жидкость.
III этап
Оставшиеся эритроциты разводят 400-450 мл 1% раствора NaCI, центрифугируют при том же режиме в течение 5 минут, удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют в растворе 8в (см. 1.1.9).
6. Для деглицеринизации эритроконцентрата необходимо дозу (250 мл) эритроконцентрата разделить приблизительно по 125 мл в два контейнера вместимостью 500 мл и отмывать так же, как и размороженную эритровзвесь. Если после 3-го центрифугирования удаляемый супернатант будет иметь интенсивное окрашивание, следует ввести 1-2 дополнительных этапа центрифугирования с использованием последнего отмывающего раствора (1% NaCI) в объемах 400-500 мл. Отмытые клетки ресуспендируют в растворе ЦНИИГПК 8в.
Теги: М
- None Found